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我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展產(chǎn)生了大量的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水.未經(jīng)利用的飼料及水產(chǎn)品代謝物導(dǎo)致養(yǎng)殖廢水中含有大量的含氮污染物，若不經(jīng)處理肆意排放會(huì)造成周圍水域富營養(yǎng)化[1]; 同時(shí)養(yǎng)殖過程中使用的抗生素殘留在水環(huán)境中會(huì)誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生抗藥性，并有可能對水產(chǎn)品產(chǎn)生毒害作用[2].目前，高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中產(chǎn)生的大量廢水及其中所含的各類污染物和殘留抗生素的處理受到越來越多的關(guān)注.
人工濕地作為一種生態(tài)處理技術(shù)，具有投資低、運(yùn)行費(fèi)用省和運(yùn)行耗能低的優(yōu)勢[3, 4]，已成功運(yùn)用于養(yǎng)殖廢水的處理[5~8].潛流人工濕地通常被分為水平潛流和垂直流，研究表明，水平潛流和垂直流人工濕地構(gòu)造和水流方式的差別以及濕地內(nèi)水力停留時(shí)間的長短，均易導(dǎo)致污水與填料接觸時(shí)間、濕地內(nèi)氧含量等的差異，從而影響到對污水中含氮污染物的去除效果[9].水平流擁有相對長距的流程，潛在的反硝化程度高[10]，而垂直流濕地內(nèi)部污水從表面流至底部時(shí)能夠與氧較好地混合，硝化反應(yīng)好且去除較多的有機(jī)物[11].有學(xué)者在考察人工濕地對抗生素的去除效果時(shí)也發(fā)現(xiàn)，垂直流人工濕地優(yōu)于水平流人工濕地[12].隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)單一的水流方式不能同時(shí)提供好氧和厭氧的環(huán)境，所以構(gòu)造復(fù)合人工濕地來提供不同的氧化還原狀態(tài)以適宜硝化和反硝化的進(jìn)行，進(jìn)而改進(jìn)凈化污水的效果[13, 14].
本研究分別構(gòu)建了水平潛流和下行-上行復(fù)合垂直流兩種構(gòu)型的人工濕地裝置，考察在不同工況下兩個(gè)人工濕地對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中含氮污染物的去除效果和影響因素，并通過對微生物活性、代謝能力及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的研究闡明人工濕地構(gòu)型對含氮污染物去除的差異，并進(jìn)一步考察兩個(gè)人工濕地對水產(chǎn)養(yǎng)殖常用抗生素的去除效果及影響因素，以期為人工濕地技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水特征污染物的去除提供借鑒.
1 材料與方法
1.1 人工濕地試驗(yàn)裝置
水平潛流和下行-上行復(fù)合垂直流人工濕地的結(jié)構(gòu)分別如圖 1、圖 2所示.裝置均由PVC材料制成，裝置中種植了蘆葦(Phragmites australis)，種植密度為50株 ·m-2.

圖 1 水平潛流人工濕地結(jié)構(gòu)

圖 2 復(fù)合垂直流人工濕地結(jié)構(gòu)
水平潛流人工濕地裝置(HF)的規(guī)格為1.5 m×0.4 m×0.8 m.裝置兩端用穿孔板隔開，形成0.15 m的布水區(qū)和集水區(qū)，布水區(qū)和集水區(qū)內(nèi)填充有0.4 m高的礫石(粒徑30~50 mm)，并在填料區(qū)的前端和后端各鋪設(shè)0.1 m的礫石(粒徑15~30 mm)，有效水深為0.6 m.主填料區(qū)依次為碎石(粒徑5~10 mm)和沸石(粒徑5~15 mm)，填充比例為3 ∶1.
復(fù)合垂直流人工濕地裝置(IVF)的規(guī)格為1.0 m×0.6 m×1.0 m.裝置中間加裝一層隔板，并在下層固定穿孔承托層，進(jìn)水通過布水管均勻布水，經(jīng)過下行和上行后，由集水管收集入集水槽中，有效水深為0.8 m.在裝置的最底層鋪設(shè)0.1 m高的礫石(粒徑15~30 mm)，下行段從下往上依此鋪設(shè)填充比例為1 ∶3的沸石(粒徑5~15 mm)和碎石(粒徑5~10 mm).上行段從下往上依次填充碎石(粒徑5~10 mm)和沸石(粒徑5~15 mm)，填充比例為1 ∶3.
1.2 進(jìn)水水質(zhì)與裝置運(yùn)行
人工濕地進(jìn)水取自某水產(chǎn)養(yǎng)殖場的生產(chǎn)河道，進(jìn)水水質(zhì)如表 1所示.兩個(gè)裝置并聯(lián)運(yùn)行，進(jìn)水量由蠕動(dòng)泵控制，全天24 h連續(xù)運(yùn)行.在人工濕地系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行之后于2014年3月~9月進(jìn)行試驗(yàn)，初設(shè)的水力停留時(shí)間為1 d，然后通過進(jìn)水量的改變控制水力停留時(shí)間和水力負(fù)荷，根據(jù)不同的工況可將試驗(yàn)分為4個(gè)階段，各階段的運(yùn)行參數(shù)如表 2所示，每階段進(jìn)行試驗(yàn)前均設(shè)有5~8 d的過渡期以確保人工濕地穩(wěn)定運(yùn)行.

表 1 試驗(yàn)進(jìn)水水質(zhì)

表 2 運(yùn)行參數(shù)
1.3 分析方法
1.3.1 常規(guī)指標(biāo)分析
試驗(yàn)過程中，常規(guī)水質(zhì)分析項(xiàng)目包括溫度、電導(dǎo)率、DO、pH、TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N.溫度和電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀測定(上海雷磁)，DO采用溶解氧儀測定(上海雷磁)，pH采用酸度計(jì)測定(美國Fisher Scientific)，其他指標(biāo)均參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》中的標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定.
1.3.2 微生物分析
當(dāng)兩個(gè)人工濕地運(yùn)行穩(wěn)定并維持水力停留時(shí)間為4 d一段時(shí)間后，分別在水平潛流人工濕地裝置中的上層前部基質(zhì)和復(fù)合垂直流人工濕地下行流的上層基質(zhì)采樣，采樣位點(diǎn)在圖 1、圖 2中有所示意，每組樣品均由寬度方向上多位點(diǎn)采集的基質(zhì)均勻混合而成.采樣后對基質(zhì)中微生物的代謝特性與多樣性及其中細(xì)菌的數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析.
微生物代謝特性與多樣性：采樣后，揀出植物根系和雜質(zhì)，取40 g加入經(jīng)高壓滅菌后的含100 mL生理鹽水的250 mL三角錐形瓶中，置搖床上以200 r ·min-1速度振蕩30 min，然后取20 mL懸液離心(1 500 r ·min-1，8 min，20℃)以去除懸浮物對光密度測定的干擾.用移液器取上清液接種于BIOLOG ECO PlateTM微平板中，每孔150 μL.密封后放置在與采樣日平均溫度相同的30℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每個(gè)樣品作3個(gè)重復(fù).分別在12、48、72、96、120、144、168、192和216 h利用多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek Synergy 4，美國)在590 nm的波長下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集.采集后，參照文獻(xiàn)[15]計(jì)算單孔平均光密度(Average Well Color Development,AWCD)，并根據(jù)多樣性公式分別計(jì)算Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù).
細(xì)菌數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成：采用Real-time PCR法檢測樣本中細(xì)菌的16S基因絕對含量.定量PCR試劑為：ABI Prower SybrGreen qPCR Master Mix (2X); 定量PCR儀為：ABI7500型熒光定量PCR儀; 細(xì)菌定量分析的引物對為：Eub338-Eub518; RT-PCR反應(yīng)參數(shù)為：1×(10 minutes at 95℃); 40×(15 seconds at 95℃; 60 seconds at 60℃).對人工濕地中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析中的Miseq高通量測序
1.3.3 抗生素分析
在水力停留時(shí)間為1~3 d的運(yùn)行階段內(nèi)，對兩個(gè)人工濕地進(jìn)出水中的3種抗生素(恩諾沙星、磺胺甲 唑、氟甲砜霉素)進(jìn)行測定.各抗生素濃度的測試方法見文獻(xiàn)[16, 17]，采用固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(SPE-HPLC-MS/MS).實(shí)驗(yàn)試劑：繪制標(biāo)線所用標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%; 有機(jī)試劑均為HPLC級; 試驗(yàn)用水均為超純水(Millipore).分析儀器：TSQ Quantum液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific); 12管防交叉固相萃取裝置(美國Supelco)等.
取500 mL水樣通過0.45 μm水相濾膜除去懸浮物，加入5 mL Na2EDTA(50 g ·L-1)絡(luò)合水樣里面的重金屬離子，用鹽酸調(diào)節(jié)水樣pH至3.0，然后用Oasis HLB SPE(500 mg ·6 mL-1，美國Waters公司)小柱進(jìn)行固相萃取富集.上樣前，SPE柱依次用6 mL甲醇和6 mL超純水進(jìn)行活化平衡; 然后水樣以流速5mL ·min-1負(fù)壓抽濾通過SPE小柱; 上樣后，用6 mL 5%甲醇水溶液淋洗SPE柱，然后在負(fù)壓下抽干30 min; 用6 mL甲醇洗脫，洗脫液收集于試管中，在35℃下用氮?dú)獯蹈? 然后，用甲醇 ∶水(3 ∶2，體積比)定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm的針頭式濾器過濾后保存于2 mL棕色小瓶內(nèi)，通過HPLC-MS/MS進(jìn)行定量分析，色譜和質(zhì)譜的分析條件見文獻(xiàn)[17].
1.4 數(shù)據(jù)分析
本研究中數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)和圖表繪制分別采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0軟件進(jìn)行.
2 結(jié)果與討論
2.1 人工濕地構(gòu)型對含氮污染物去除的影響
兩個(gè)人工濕地對各類含氮污染物均有一定的去除效果，人工濕地對污染物的去除效果隨停留時(shí)間的變化呈現(xiàn)出波動(dòng).水平潛流和復(fù)合垂直流人工濕地在各階段內(nèi)對各類含氮污染物的去除效果如圖 3所示，從中可以發(fā)現(xiàn)人工濕地的構(gòu)型對含氮污染物的去除效果具有較為明顯的差異.

圖 3 兩個(gè)人工濕地對含氮污染物的去除效果
在總氮去除方面，當(dāng)水力停留時(shí)間為2 d時(shí)，兩個(gè)人工濕地的去除率均有下降，而當(dāng)水力停留時(shí)間延長至3 d及更高時(shí)，兩個(gè)人工濕地對TN的去除率均顯著提升(P <0.05)，且去除率保持相對穩(wěn)定的水平.兩個(gè)人工濕地在水力停留時(shí)間為3 d時(shí)去除效果最好，去除率可分別達(dá)到53%和58%，且去除效果較為穩(wěn)定，這與Wu等[18]設(shè)置水力停留時(shí)間為2.4 d的試驗(yàn)結(jié)果相似.總的來說，復(fù)合垂直流對TN的去除率均高于水平潛流人工濕地，說明復(fù)合垂直流人工濕地的構(gòu)型可以對TN的去除產(chǎn)生影響.
在NH4+-N去除方面，兩個(gè)潛流人工濕地對NH4+-N的去除率均高于60%，當(dāng)水力停留時(shí)間維持在3 d及以上時(shí)，復(fù)合垂直流人工濕地對NH4+-N的去除率顯著高于水平流(P <0.05)，在水力停留時(shí)間為3 d時(shí)復(fù)合垂直流人工濕地的去除率最高可達(dá)到80%.NH4+-N主要通過微生物的硝化作用去除[19]，與人工濕地內(nèi)部的溶解氧濃度具有較大關(guān)系.當(dāng)水力停留時(shí)間維持在3 d及以上時(shí)，水平潛流人工濕地內(nèi)部的復(fù)氧條件相對不足，去除率有所降低，復(fù)合垂直流人工濕地內(nèi)部則能夠通過水流方式提高與氧的混合，較好地供氧能夠促進(jìn)微生物硝化反應(yīng)的進(jìn)行[11]，從而促進(jìn)了NH4+-N的去除.
在NO3--N去除方面，兩個(gè)人工濕地的去除率差異不大.當(dāng)水力停留時(shí)間為4 d時(shí)，兩個(gè)人工濕地的去除率均在75%以上，且較為穩(wěn)定; 水力停留時(shí)間降低時(shí)，兩個(gè)人工濕地去除率均顯著降低(P <0.05)，并且在水力停留時(shí)間為2 d達(dá)到最低.由于硝化、反硝化作用的速率有限，隨著水力停留時(shí)間的減少，NO3--N的去除量明顯降低.不同構(gòu)型的人工濕地在高水力停留時(shí)間的工況下對NO2--N的去除效果均較好，水力停留時(shí)間為3 d及以上時(shí)，亞硝態(tài)氮去除率均大于95%.
2.2 人工濕地構(gòu)型對濕地系統(tǒng)內(nèi)微生物的影響
2.2.1 人工濕地構(gòu)型對微生物碳源代謝特性及多樣性的影響
AWCD值反映了微生物群落對不同碳源代謝的總體情況，其變化速率反映了微生物的代謝活性.水平潛流人工濕地上層前部與復(fù)合垂直流人工濕地上層基質(zhì)不同時(shí)間的AWCD值如圖 4所示.在這兩個(gè)不同構(gòu)型的人工濕地中，復(fù)合垂直流對碳源的利用程度高于水平潛流，微生物群落代謝功能的差異可能與不同構(gòu)型濕地中溶解氧濃度和污染物內(nèi)部降解規(guī)律有關(guān).

圖 4 兩個(gè)人工濕地基質(zhì)樣品AWCD值隨時(shí)間的變化
為研究兩個(gè)人工濕地上層前部基質(zhì)微生物群落功能多樣性，選擇96 h作為取樣時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)多樣性公式分別計(jì)算Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù).如表 3所示，復(fù)合垂直流的各項(xiàng)指數(shù)均略高于水平潛流人工濕地，兩者之間并沒有顯著差異(P >0.05).人工濕地上層的復(fù)氧條件較好，同時(shí)進(jìn)水端污染物濃度較高，微生物表現(xiàn)出較高的代謝程度[20].在本研究中兩個(gè)不同構(gòu)型的人工濕地微生物的表現(xiàn)相當(dāng)，說明構(gòu)型對入流端基質(zhì)微生物的代謝及多樣性的影響不大.

表 3 兩個(gè)人工濕地基質(zhì)樣品中微生物多樣性指數(shù) 1)
2.2.2 人工濕地構(gòu)型對細(xì)菌數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成的影響
不同構(gòu)型人工濕地中的水流方式可以影響人工濕地的理化參數(shù)并因此影響其基質(zhì)中微生物生物量的空間分布[21].采用定量PCR對兩個(gè)人工濕地基質(zhì)樣品微生物中的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行測試，結(jié)果顯示水平潛流人工濕地上層前部的基質(zhì)細(xì)菌數(shù)量為1.1×106，而復(fù)合垂直流人工濕地上層基質(zhì)細(xì)菌數(shù)量為6.0×106，顯著高于水平潛流人工濕地(P <0.05).在兩種構(gòu)型中，上層基質(zhì)細(xì)菌的數(shù)量通常都是較多的[22, 23]，這說明不同構(gòu)型的水流方式對入流端基質(zhì)中的細(xì)菌數(shù)量產(chǎn)生影響.
采用高通量測序?qū)蓚€(gè)人工濕地基質(zhì)樣品微生物中的細(xì)菌進(jìn)行測試，可進(jìn)一步分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異.不同樣品按照“門”的群落結(jié)構(gòu)如圖 5所示.在所有的濕地樣品中，變形菌門(Proteobacteria)的豐度最高，綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠硫細(xì)菌(Chlorobi)和厚壁菌門(Firmicutes)的豐度也較高.研究中發(fā)現(xiàn)變形菌門是主要的門類，這與人工濕地及活性污泥中均類似[24]，因?yàn)樽冃尉T包括很多與碳、氮和硫循環(huán)中相關(guān)的細(xì)菌[25].

圖 5 不同樣品的群落結(jié)構(gòu)組成(門)
不同樣品按照“屬”的群落結(jié)構(gòu)如圖 6所示，除去無法鑒定的微生物，比例較高的主要有Denitratisoma屬和Nitrospira屬.Denitratisoma屬于變形菌門β-變形菌綱紅環(huán)菌目，其作為一種反硝化細(xì)菌主要參與人工濕地中的脫硝過程[26].反硝化過程主要在厭氧條件下進(jìn)行，所以Denitratisoma在兩個(gè)人工濕地的入流端基質(zhì)中復(fù)合垂直流略高于水平潛流，而2.1節(jié)中水力停留時(shí)間為4 d時(shí)水平潛流對NO3--N的去除率略高，說明人工濕地系統(tǒng)對NO3--N的去除主要發(fā)生在后端或下層.Nitrospira屬于慢生型菌，底物親和力常數(shù)較低，通常在低濃度底物下生長[27].從圖 6可以看到，Nitrospira在復(fù)合垂直流人工濕地上層基質(zhì)中分布比例相對較多，未鑒定到屬的亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)也有較多分布，表明硝化作用較好，這與2.1節(jié)中水力停留時(shí)間為4 d時(shí)復(fù)合垂直流對NH4+-N的去除有較好的效果一致.

圖 6 不同樣品的群落結(jié)構(gòu)組成(屬)
2.3 人工濕地構(gòu)型對抗生素去除的影響
兩個(gè)人工濕地對抗生素去除效果如圖 7所示，從中可知水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水進(jìn)水中恩諾沙星、磺胺甲 唑和氟甲砜霉素的平均濃度分別為75.36、98.07和556.48 ng ·L-1，其中氟甲砜霉素的濃度明顯高于其他兩種抗生素.人工濕地構(gòu)型對抗生素的去除效果相差不大，但不同抗生素的去除效果存在一定的差異：恩諾沙星的去除率明顯大于磺胺甲 唑和氟甲砜霉素，氟甲砜霉素的去除效果最差.水力停留時(shí)間對恩諾沙星和氟甲砜霉素的去除無顯著影響(P >0.05)，而對磺胺甲 唑的影響顯著(P <0.05)，磺胺甲 唑的去除率隨著水力停留時(shí)間的增加有明顯的升高，水平潛流人工濕地的去除率從4%升到59%，復(fù)合垂直流人工濕地從3%升到55%.

圖 7 兩個(gè)人工濕地對3種抗生素的去除效果
抗生素在人工濕地中的去除受光解、水解、植物吸附、填料吸附和微生物降解共同作用的影響[28, 29].3種抗生素由于結(jié)構(gòu)不同，其去除機(jī)制存在一定的差異.恩諾沙星為氟喹諾酮類抗生素，具有喹諾酮類的兩個(gè)六元環(huán)拼合的雙環(huán)結(jié)構(gòu)并引入了氟原子，易發(fā)生光解、易被吸附但不易發(fā)生水解[30, 31]，由于潛流人工濕地中光解的作用可以忽略，試驗(yàn)結(jié)果表明其去除又與人工濕地構(gòu)型、水力停留時(shí)間無關(guān)，說明其在人工濕地中主要通過填料的吸附作用被去除.磺胺甲 唑?yàn)榛前奉惪股?，進(jìn)入環(huán)境后降解較慢.本試驗(yàn)結(jié)果中水平流人工濕地相對較差的氧環(huán)境更有利于磺胺甲 唑的去除，說明其在人工濕地中主要的去除途徑是厭氧微生物降解，這與鐘振興等[32]的研究結(jié)果一致; 同時(shí)在人工濕地中水力停留時(shí)間延長后，去除率提升，水平潛流人工濕地在水力停留時(shí)間為3 d時(shí)能夠達(dá)到50%以上的去除率，與Hijosa-Valsero等[33]的研究結(jié)果相似.氟甲砜霉素為氯霉素類抗生素，具有氟、氯多個(gè)鹵代基團(tuán)和苯環(huán)結(jié)構(gòu)，研究者發(fā)現(xiàn)其在太陽光照射下不發(fā)生光解[34]，且不易發(fā)生水解[35].本試驗(yàn)研究表明進(jìn)水中氟甲砜霉素濃度較高且性質(zhì)較為穩(wěn)定，說明氟甲砜霉素在常規(guī)人工濕地中難以被去除，有效的去除方法有待進(jìn)一步研究.
3 結(jié)論
水平潛流人工濕地和下行-上行復(fù)合垂直流人工濕地可以去除水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的各類含氮污染物，其中復(fù)合垂直流因其水流方式可產(chǎn)生較好的溶解氧條件，基質(zhì)中上層的微生物活性和多樣性均較高，對污染物的去除效果相對較好，水力停留時(shí)間為3~4 d時(shí)對各類污染物的去除效果可達(dá)到最優(yōu).兩種人工濕地對恩諾沙星的去除效果優(yōu)于磺胺甲 唑和氟甲砜霉素，水力停留時(shí)間的延長有助于提高磺胺甲 唑的去除率.說明通過改進(jìn)人工濕地工藝、優(yōu)化工藝參數(shù)可以促進(jìn)養(yǎng)殖廢水中含氮污染物和抗生素的去除.人工濕地對不同種類抗生素的去除機(jī)理較為復(fù)雜，后續(xù)擬通過穩(wěn)定同位素示蹤法、抗性基因檢測等手段進(jìn)一步揭示其機(jī)制.